le Gélose au citrate de Simmons C'est un milieu solide utilisé comme test biochimique pour l'identification des micro-organismes, en particulier les bacilles Gram négatifs. Le support original a été créé par Koser en 1923.
Le milieu Citrate de Koser se composait d'un bouillon contenant du phosphate de sodium, du phosphate d'ammonium, du phosphate monopotassique, du sulfate de magnésium et du citrate de sodium..
Comme on peut le voir, la seule source de carbone dans le milieu est le citrate, et l'azote est le phosphate d'ammonium, en omettant les protéines et les glucides comme source de ces éléments, ils sont couramment présents dans d'autres milieux..
Par conséquent, les bactéries inoculées dans ce milieu ne peuvent se reproduire que si elles sont capables d'absorber le carbone du citrate. Le test était positif s'il y avait de la turbidité dans le milieu, mais il avait l'inconvénient qu'une turbidité non spécifique pouvait se produire.
Ce problème a été résolu par Simmons en ajoutant du bleu de bromothymol et de la gélose à la formule originale de Koser. Bien que le principe soit le même, il est interprété différemment.
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Certaines bactéries ont la capacité de survivre en l'absence de fermentation ou de production d'acide lactique, nécessitant de l'énergie grâce à l'utilisation d'autres substrats. Dans ce test, la seule source de carbone offerte est le citrate.
Les bactéries capables de survivre dans ces conditions métabolisent rapidement le citrate par une voie alternative à la voie traditionnelle, en utilisant le cycle de l'acide tricarboxylique ou le cycle de fermentation du citrate..
Le catabolisme du citrate par les bactéries implique un mécanisme enzymatique sans l'intervention de la coenzyme A. Cette enzyme est connue sous le nom de citricase (citrate oxaloacétate lyase) ou citrate desmolase. La réaction nécessite la présence d'un cation divalent, qui dans ce cas est fourni par le magnésium.
La réaction génère de l'oxaloacétate et du pyruvate, qui donnent alors naissance à des acides organiques au milieu d'un pH alcalin formé par l'utilisation de la source d'azote. Ces acides organiques sont utilisés comme source de carbone générant des carbonates et des bicarbonates, alcalinisant davantage l'environnement..
Le milieu citrate de Simmons doit être légèrement inoculé en queue de poisson à l'aide d'une boucle ou d'une aiguille droite, et incubé pendant 24 heures à 35-37 ° C. Après le temps, les résultats sont observés.
L'ensemencement se fait uniquement à la surface de la gélose. Ne pas percer.
Si le milieu reste de la couleur d'origine (vert) et qu'il n'y a pas de croissance visible, le test est négatif, mais si le milieu devient bleu, cela indique la présence de produits alcalins, qui est détectée par l'indicateur de pH. Dans ce cas, le test est positif.
Cela se produit parce que si la bactérie utilise le carbone du citrate, elle est également capable de prélever l'azote du phosphate d'ammonium avec lequel elle libère de l'ammoniac, alcalinisant le milieu..
En revanche, si la croissance des bactéries est observée dans le milieu, mais qu'il n'y a pas de changement de couleur, le test doit également être considéré comme positif, car s'il y a croissance, cela signifie que la bactérie a pu utiliser le citrate comme source de carbone. , même s'il n'y a pas de changement de pH pour le moment (cela peut parfois prendre du temps).
En cas de doute sur l'interprétation de la couleur finale, elle peut être comparée à un tube de citrate non inoculé.
Peser 24,2 g de milieu déshydraté pour un litre d'eau. Mélangez et laissez reposer environ 5 minutes. Terminez de dissoudre le milieu en chauffant pendant 1 à 2 minutes, en secouant fréquemment.
Verser 4 ml dans des tubes à essai et autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes. En sortant de l'autoclave, inclinez à l'aide d'un support de manière à ce que la gélose se solidifie en forme de bec de flûte avec petit bloc ou fond et plus de biseau.
Le pH final du milieu citrate est de 6,9 (couleur verte). Ce milieu est très sensible aux changements de pH.
À pH 6 ou moins, le milieu devient jaune. Cette couleur n'est pas observée dans le test avec des bactéries.
Et à pH 7,6 ou plus, le milieu prend une couleur bleu prussien profond..
La gélose au citrate de Simmons est utilisée pour l'identification de certains microorganismes, en particulier les bacilles appartenant à la famille des Enterobacteriaceae et d'autres bacilles non fermentants du glucose.
Le milieu citrate de Simmons est un test très délicat, car des faux positifs peuvent être obtenus si certaines erreurs sont commises..
Les précautions à prendre sont les suivantes:
Un inoculum bactérien très épais ou chargé ne doit pas être fait, car il peut provoquer le développement d'une couleur jaune cuivré sur le lieu de plantation, sans affecter le reste du milieu, mais cela peut laisser croire qu'il y a croissance. Cela ne signifie pas tester la positivité.
De même, un inoculum épais peut générer un faux positif, car les composés organiques préformés dans les parois cellulaires des bactéries mourantes peuvent libérer suffisamment de carbone et d'azote pour activer l'indicateur de pH..
Par conséquent, l'idéal est de semer à l'aide de l'aiguille au lieu du manche en platine, pour éviter de prélever du matériel.
Par contre, lorsque la batterie de tests biochimiques est semée pour l'identification du microorganisme en question, il est important que le test au citrate soit le premier à être inoculé, pour éviter le report de protéines ou de glucides d'un autre milieu. ..
Dans ces circonstances, il est possible d'obtenir un faux positif, car l'une de ces substances introduites par erreur sera métabolisée et entraînera une modification du pH..
Une autre façon d'éviter le transfert de substances est de bien brûler la boucle et de prélever un nouvel inoculum entre un test et un autre..
Des précautions doivent également être prises lorsque vous touchez la colonie pour effectuer l'inoculum, car il doit être évité de faire glisser une partie de la gélose de la culture d'où proviennent les bactéries, en raison de ce qui précède..
En ce sens, Matsen, Sherris et Branson recommandent de diluer l'inoculum dans une solution physiologique avant d'inoculer le test de citrate pour éviter le transfert d'autres sources de carbone.
Il faut tenir compte du fait que l'intensité de la couleur produite lorsque le test est positif peut varier en fonction du commerce.
En outre, il existe des micro-organismes dont le test est positif à 24 heures, mais il existe d'autres souches qui nécessitent 48 heures ou plus pour produire un changement de pH..
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