le Gélose Thayer Martin est un milieu solide hautement nutritif et sélectif pour l'isolement de Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae; tous deux connus sous le nom de Neisserias pathogènes ou cliniquement importants.
L'une des caractéristiques spéciales les plus importantes de la Thayer Martin Agar est sa haute teneur en compléments nutritionnels. Cette propriété est essentielle, car les Neisserias sont des microorganismes très exigeants du point de vue nutritionnel et ne poussent donc pas dans les milieux courants..
En revanche, comme ces microorganismes se trouvent normalement dans des zones non stériles, il est nécessaire d'ajouter des inhibiteurs qui empêchent la croissance de la flore qui l'accompagne, sans affecter le développement du genre Neisseria.
Cette gélose est composée de gélose à base de GC, d'hémoglobine, de compléments nutritionnels complémentaires et d'un complexe de substances inhibitrices (antibiotiques et antifongiques). Les maisons commerciales vendent chacun des suppléments séparément.
L'échantillon à semer dans ce milieu dépendra du microorganisme recherché. Afin de Neisseria gonorrhée les échantillons idéaux sont les sécrétions vaginales et urétrales. Tandis que pour Neisseria meningitidis les échantillons les plus utilisés sont les exsudats du LCR, du pharynx et du nasopharynx.
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Les neisserias sont des micro-organismes classés comme gênants et leur isolement est donc difficile. Pour cette raison, Thayer Martín est un médium complexe et chacun de ses composants remplit une fonction qui est expliquée ci-dessous:
La gélose GC contient de la protéose peptone, de la fécule de maïs, du chlorure de sodium, du phosphate dipotassique, du phosphate monopotassique et de l'agar-agar. Ses composants fournissent les nutriments de base pour le développement microbien, neutralisent les acides gras toxiques, aident à maintenir l'équilibre osmotique, définissent le pH et confèrent une consistance solide au milieu..
L'hémoglobine fournit les facteurs V et X (nicotinamide adénine dinucléotide NAD et hémine respectivement). Pour cette raison, les espèces Haemophilus poussent également dans ce milieu. L'hémoglobine peut être obtenue dans le commerce sous une forme déshydratée ou du sang bovin défibriné frais peut être ajouté au milieu..
D'autre part, un complément d'enrichissement doit également être ajouté au milieu Thayer-Martin, car les nutriments contenus dans la gélose de base ne sont pas suffisants pour les besoins du genre Neisseria..
Le complément d'enrichissement le plus couramment utilisé est appelé isovitalex. Il contient de la glutamine, de l'adénine, du NAD, de la cocarboxylase, de la guanine, du nitrate ferrique, de l'acide p-amino benzoïque, de la vitamine B12, de la thiamine et du glucose. Tous ces composés sont nécessaires au bon développement des Neisserias pathogènes.
Comme il s'agit d'un milieu hautement nutritif, il faut utiliser des inhibiteurs qui empêchent la croissance des microorganismes de la flore habituelle de la région et favorisent ainsi l'isolement du genre Neisseria..
Le complexe inhibiteur est composé de vancomycine, de colistine et de nystatine. La vancomycine inhibe la croissance des bactéries Gram positives, la colistine empêche la croissance des bactéries Gram négatives telles que Pseudomonas et certaines Neisserias saprophytes, et la nystatine agit sur les levures comme Candida albicans.
Cependant, Thayer Martin Agar a été modifié plus tard; les changements consistaient en l'ajout de triméthoprime, l'augmentation de la quantité d'agar et l'ajout de glucose supplémentaire. Ces changements ont considérablement amélioré la récupération des espèces de Neisseria gonorrhoeae.
Il convient de noter que le triméthoprime inhibe la croissance du genre Proteus et sa formation d'essaimage qui en résulte. En ce sens, les antibiotiques sont ceux qui confèrent le caractère sélectif au milieu Thayer Martin.
Peser 8,2 g de milieu GC déshydraté et mettre en suspension dans 100 ml. Mélanger et faire bouillir pendant 1 minute en remuant fréquemment pour dissoudre complètement. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes.
Suspendre 2 g d'hémoglobine déshydratée dans 2 ou 3 ml d'eau distillée chaude jusqu'à ce qu'un mélange uniforme se forme. Ajouter plus d'eau petit à petit pour obtenir un volume de 100 ml. La suspension doit être homogène avant la stérilisation.
Stériliser en autoclave pendant 15 minutes.
Reconstituer le flacon commercial avec le diluant fourni par la même société commerciale. Bien mélanger. La quantité de diluant à utiliser sera spécifiée dans les instructions du kit..
Reconstituer le flacon avec le diluant fourni par la société commerciale. Bien mélanger. La quantité de diluant à utiliser sera spécifiée dans les instructions du kit..
Pour 100 ml de gélose GC, procédez comme suit:
Lorsque la gélose GC quitte l'autoclave, laissez-la refroidir à une température d'environ 50 ° C et ajoutez 2 ml de la solution d'hémoglobine préparée, 2 ml du supplément d'enrichissement (isobitalex ou britalex) et 2 ml du supplément d'inhibition. Mélanger et servir dans des boîtes de Pétri stériles..
Laisser se solidifier et conserver au réfrigérateur jusqu'à utilisation.
La couleur du milieu préparé est rouge cerise. Le pH final du milieu est de 7,2 ± 0,2
Peser 8,2 g de milieu GC déshydraté et mettre en suspension dans 100 ml. Ajouter 1 g d'agar-agar et ajouter 0,3 g de glucose. Mélanger et faire bouillir pendant 1 minute en remuant fréquemment pour dissoudre complètement. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes.
Préparez l'hémoglobine et le supplément d'enrichissement comme décrit ci-dessus.
Le complément d'inhibition utilisé est le V.C.N.T (vancomycine, colistine, nystatine, triméthoprime).
Procéder comme décrit pour la gélose Thayer Martin originale.
Laisser la gélose Thayer Martin se réchauffer avant que les échantillons ne soient striés. Les échantillons couramment utilisés sont les prélèvements pharyngés, les prélèvements nasaux, les écoulements vaginaux, urétraux et / ou rectaux et le LCR..
Utilisez des échantillons frais et faites des inoculums solides sur la gélose. Les échantillons sont semés directement par décharge de matière, puis par des stries d'épuisement à la surface.
Les plaques sont incubées à 35-37 ° C pendant 24 à 48 heures dans un bocal microaérophile (5% COdeux). A la fin du temps d'incubation, les plaques sont examinées à la recherche de petites colonies, de couleur grise et parfois d'aspect mucoïde..
Effectuer des tests de Gram et des tests biochimiques de confirmation sur des colonies suspectes.
Les souches microbiennes suivantes peuvent être utilisées pour effectuer un contrôle qualité sur la gélose Thayer Martin.
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 et Neisseria meningitidis ATCC 13090; un développement satisfaisant est attendu dans les deux souches.
Les souches suivantes doivent également être incluses: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 et Candida albicans ATCC 10231. Dans tous, une inhibition totale ou partielle est attendue dans ce milieu..
-Il faut garder à l'esprit que les bactéries résistantes aux inhibiteurs utilisés peuvent se développer dans le milieu.
-Il existe des souches de Neisseria gonorrhée qui peut être sensible à la concentration de vancomycine utilisée. Pour cette raison, il est recommandé d'utiliser de la gélose au chocolat supplémentée en isovitalex, mais sans inhibiteurs..
-Il existe des souches de levures résistantes à la nystatine qui peuvent se développer dans ce milieu et interférer avec l'isolement des Neisserias pathogènes, en particulier des gonocoques..
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