le milieu de ou la gélose de fermentation au glucose est une gélose semi-solide spécialement conçue pour l'étude du métabolisme oxydatif et fermentaire des glucides dans un groupe important de microorganismes autres que les entérobactéries, appelés bacilles Gram négatifs non entériques.
Il a été créé par Hugh et Leifson; ces chercheurs ont réalisé que les moyens conventionnels d'étudier la production d'acide à partir des glucides ne convenaient pas à ce groupe spécifique de bactéries.
En effet, les bâtonnets Gram négatifs non entériques produisent généralement de faibles quantités d'acides, contrairement aux Enterobacteriaceae..
En ce sens, le milieu OF a des caractéristiques particulières qui permettent de détecter les petites quantités d'acide formées, à la fois par voie oxydative et fermentative. Ces différences sont liées à la quantité de peptones, de glucides et d'agar..
Ce milieu contient moins de peptones et une concentration plus élevée de glucides, réduisant ainsi les produits qui alcalinisent le milieu du fait du métabolisme des protéines et augmentant la production d'acides grâce à l'utilisation de glucides..
En revanche, la diminution de la quantité d'agar favorise la dissémination de l'acide produit dans tout le milieu, en plus de nous permettre d'observer la motilité.
Le milieu OF est composé de peptone, de chlorure de sodium, de bleu de bromothymol, de phosphate dipotassique, d'agar et d'un glucide. Le glucide le plus courant est le glucose, mais d'autres peuvent être utilisés en fonction de celui que vous souhaitez étudier, comme le lactose, le maltose, le xylose, entre autres..
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Comme tout milieu de culture, le milieu OF doit contenir des substances nutritives garantissant la croissance bactérienne; ces substances sont des peptones.
De son côté, le glucide fournit de l'énergie et sert en même temps à étudier le comportement du microorganisme contre lui, c'est-à-dire qu'il permet de classer la bactérie comme un organisme oxydant, fermentaire ou non saccharolytique..
Le milieu OF contient un rapport peptone / glucide de 1: 5 par opposition à un milieu conventionnel de 2: 1. Cela garantit que la quantité d'amines alcalines formées à partir de la dégradation des peptones ne neutralise pas la formation d'acides faibles..
En revanche, le milieu contient du chlorure de sodium et du phosphate dipotassique. Ces composés stabilisent osmotiquement le milieu et régulent respectivement le pH. Le bleu de bromothymol est l'indicateur de pH, qui fait passer la couleur du milieu du vert au jaune avec la production d'acide..
Certains micro-organismes peuvent utiliser des glucides par les voies oxydantes ou de fermentation, tandis que d'autres n'empruntent aucune des deux voies..
Cela dépend des caractéristiques de chaque micro-organisme. Par exemple, certains microorganismes aérobies stricts peuvent oxyder certains glucides, et les anaérobies facultatifs peuvent s'oxyder et fermenter en fonction de l'environnement qui les entoure, tandis que d'autres n'oxydent pas ou ne fermentent pas les glucides (en tant qu'acarolytiques).
Enfin, il existe une modification du milieu OF recommandée par le CDC qui contient une base OF spéciale avec du rouge de phénol comme indicateur..
Le processus d'oxydation du glucose ne nécessite pas de phosphorylation du glucose, tout comme le processus de fermentation. Dans ce cas, le groupe aldéhyde est oxydé en un groupe carboxyle, ce qui donne de l'acide gluconique. Celui-ci est à son tour oxydé en 2-cétogluconique.
Ce dernier s'accumule ou se décompose en deux molécules d'acide pyruvique. Ce système nécessite la présence d'oxygène ou d'un composé inorganique comme accepteur d'électrons final..
La production d'acides par cette voie est plus faible que celle obtenue par la voie de fermentation.
Pour que la fermentation du glucose se produise par l'une des voies disponibles, il doit d'abord être phosphorylé, devenant ainsi du glucose-6-phosphate.
La fermentation du glucose peut emprunter plusieurs voies, la principale est la voie Embden-Meyerhof-Parnas, mais elles peuvent également emprunter la voie Entner-Doudoroff, ou la voie de l'hexose monophosphate Warburg-Dickens, également connue sous le nom de la dégradation des pentoses..
La voie choisie dépendra du système enzymatique que possède le micro-organisme..
Lors de la fermentation du glucose par la voie Embden-Meyerhof-Parnas, il est divisé en deux molécules de triose, pour ensuite être dégradé en divers composés carbonés, jusqu'à la formation de glycéraldéhyde-3-phosphate. De là, une substance intermédiaire provient, qui est l'acide pyruvique..
A partir de là, divers types d'acides mixtes se formeront qui peuvent varier d'une espèce à l'autre..
Ce système se produit en l'absence d'oxygène et nécessite un composé organique comme accepteur d'électrons final..
Dans la fermentation du glucose via la voie Entner-Doudoroff, le glucose 6-phosphate devient glucono-ᵼ-lactone-6-phosphate et à partir de là, il est oxydé en 6-phosphogluconate et 2-céto-3-désoxy-6- phosphogluconate, pour forment enfin de l'acide pyruvique. Cette voie a besoin d'oxygène pour que la glycolyse se produise.
Cet itinéraire est un hybride des 2 précédents. Il commence de manière similaire à la voie Entner-Doudoroff, mais plus tard, le glycéraldéhyde-3-phosphate est formé comme précurseur de l'acide pyruvique, comme cela se produit dans la voie Embden-Meyerhof-Parnas..
Peser:
2 g de peptone
5 g de chlorure de sodium
10 g de D-glucose (ou le glucide à préparer)
0,03 g de bleu de bromothymol
3 gr d'agar
0,30 g de phosphate dipotassique
1 litre d'eau distillée.
Mélanger tous les composés sauf les glucides et dissoudre dans 1 litre d'eau distillée. Chauffer et secouer jusqu'à dissolution complète.
En refroidissant à 50 ° C, ajoutez 100 ml de glucose à 10% (filtré).
Répartir de manière aseptique 5 ml de milieu OF dans des tubes à essai à capuchon en coton et autoclave à 121 ° C, 15 livres de pression pendant 15 minutes.
Laisser solidifier en position verticale.
Le pH du milieu doit être de 7,1. La couleur du milieu préparé est verte.
Conserver au réfrigérateur.
Le milieu OF est un milieu spécial pour déterminer le comportement métabolique d'un micro-organisme vis-à-vis d'un glucide. Surtout pour ceux qui forment peu, peu ou pas d'acides.
Pour chaque microorganisme, 2 tubes OF sont nécessaires, les deux doivent être inoculés avec le microorganisme à étudier. La colonie est prise avec une poignée droite et une ponction est pratiquée au centre du tube sans atteindre le fond; plusieurs crevaisons peuvent être pratiquées, tant qu'il n'y a aucun intérêt à observer la motilité.
Une couche de vaseline liquide stérile ou de paraffine fondue stérile (environ 1 à 2 ml) est ajoutée à l'un des tubes et est étiquetée avec la lettre «F». L'autre tube est laissé d'origine et porte la lettre «O». Les deux tubes sont incubés à 35 ° C et observés quotidiennement pendant 3 à 4 jours..
Tableau: Classification des microorganismes selon leur comportement dans des tubes OF ouverts (oxydants) et fermés (fermentatifs)
Le gaz est observé avec la formation de bulles ou le déplacement de la gélose.
Il est à noter qu'un organisme qui n'oxyde que du glucose mais ne le fermente pas, ne pourra pas non plus fermenter d'autres glucides, en tout cas il ne fera que l'oxyder. Par conséquent, dans cette situation, le tube scellé pour l'étude d'autres glucides sera omis..
De plus, la motilité peut être observée dans le milieu OF.
Motilité positive: croissance non limitée à la zone d'inoculation. Il y a une croissance vers les côtés du tube.
Motilité négative: croissance uniquement dans l'inoculum initial.
Les souches suivantes peuvent être utilisées comme contrôles de qualité: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Oui Moraxella sp. Les résultats attendus sont:
-Certains micro-organismes ne peuvent pas se développer en milieu OF. Dans ces cas, le test est répété mais 2% de sérum ou 0,1% d'extrait de levure sont ajoutés au milieu..
-Les réactions d'oxydation ne sont souvent observées que près de la surface et le reste du milieu peut rester vert, de la même manière qu'il est pris comme positif.
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