La protéinase K C'est une enzyme qui appartient au groupe des sérine protéases, c'est-à-dire qu'elle possède un acide aminé sérine dans son centre catalytique actif et a pour fonction de rompre les liaisons peptidiques par hydrolyse. À son tour, cette enzyme appartient à la famille des protéines de subtilisine (peptidase S8).
La protéinase K a un poids moléculaire (MW) de 28900 daltons et a été isolée pour la première fois en 1974 dans des extraits du champignon Album Engyodontium, anciennement connu sous le nom de Album Tritirachium Limber.
Il a une capacité protéolytique élevée, démontrée par sa capacité à dégrader la kératine présente dans les cheveux. Le mot kératine en anglais s'écrit «kératine», d'où son nom de «protéinase K».
En raison de son pouvoir élevé de cliver les protéines natives, cette enzyme est utile dans diverses techniques de biologie moléculaire. Principalement utilisé pour isoler et préparer des acides nucléiques de poids moléculaire élevé (MW).
La protéinase K agit en libérant de l'ADN nucléaire, tout en détruisant les protéines et en inactivant les RNases et les DNases, c'est-à-dire qu'elle élimine les nucléases dans les préparations d'ADN et d'ARN..
En revanche, on a vu que la protéinase K pouvait hydrolyser certaines protéines natives dénaturées, ce qui a suscité l'intérêt des chercheurs pour son utilisation dans l'étude des protéines prion (PrPC).
Cependant, malgré leur pouvoir protéolytique élevé, il existe des protéines résistantes à l'action de la protéinase K. Parmi elles, certaines protéines anormales appelées prions (PrPSc), associées à des encéphalopathies spongiformes transmissibles..
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La protéinase K a une structure tertiaire composée de trois couches, avec une feuille β à sept chaînes interposée entre deux couches d'hélices. Du fait qu'il appartient à la famille des peptidases S8, il se caractérise par une triade catalytique dans son site actif, dont l'ordre séquentiel est (Asp, His et Ser), ce qui les différencie des autres familles de peptidases..
Cette enzyme du groupe des sérine protéases est caractérisée par l'hydrolyse des liaisons peptidiques proches du groupement carboxylique des acides aminés aliphatiques et aromatiques..
D'autre part, il est capable d'agir en présence de certaines substances corrosives, telles que le dodécyl sulfate de sodium (SDS), le Tris-HCL et l'EDTA, qui sont utilisées pour aider à la dénaturation des protéines, leur faisant perdre leur structure native. ..
Il s'agit d'une étape préliminaire dans la préparation de protéines pour la technique d'électrophorèse. La gamme de pH à laquelle agit la protéinase K est assez large (2,0 à 12,0), avec un pH optimal entre 7,5 et 12,0, et son point isoélectrique est de 8,9. Comme on peut le voir, il est actif contre une très large gamme de pH..
Une autre caractéristique qui ressort de la protéinase K est sa stabilité en présence de températures élevées (50 - 60 ° C)..
La protéinase K nécessite la présence de l'ion calcium, bien que cela n'affecte pas son activité, s'il est essentiel de maintenir sa stabilité.
Pour que la protéinase K digère complètement le substrat, un temps de contact d'environ 5 minutes à 2 heures est nécessaire..
Cependant, dans ce sens, Daza et al.ont comparé la pureté de l'ADN obtenu à divers temps d'exposition à la protéinase K, et ont conclu qu'une incubation prolongée (jusqu'à 24 h) améliore significativement la qualité de l'ADN..
Or, par rapport à la concentration de l'enzyme protéinase K utilisée dans les différents protocoles, on peut dire qu'elle est très variée.
Il peut être utilisé de très faibles concentrations (5 µg / ml) à des concentrations de 500 µg / ml. Mais les concentrations de travail les plus fréquentes vont de 50 à 100 μg / ml, en particulier pour la digestion des protéines et l'inactivation de la nucléase. Bien que pour le traitement des tissus, une concentration de 2 mg / ml soit nécessaire.
Ses applications sont très larges et peuvent être résumées comme suit:
-Il est utilisé dans la digestion des protéines et l'extraction de l'ADN par diverses méthodes telles que: relargage, PK-SDS, bromure de cétyl-triméthylammonium (CTAB), acétate de potassium modifié et extraction à l'iodure de sodium..
-Inactivation des nucléases (RNases et DNases).
-Dans la technique d'hybridation in situ (HIS), pour faciliter la libération d'acide nucléique, en plus d'éliminer les protéines indésirables.
-Modification des protéines.
-Au niveau de la recherche, dans diverses études.
Plusieurs études comparatives ont été menées entre les techniques d'extraction d'ADN qui utilisent la protéinase K, avec d'autres qui ne l'utilisent pas et toutes concluent qu'il y a de plus grands avantages à utiliser l'enzyme. Les avantages sont les suivants:
-Un ADN de poids moléculaire élevé, de haute qualité et de pureté est obtenu.
-L'ADN extrait est stable jusqu'à 3 mois.
L'ADN extrait peut être utilisé dans les techniques suivantes: transfert de Southern, réaction en chaîne par polymérase (PCR), électrophorèse, entre autres..
Diverses recherches ont conclu que les prions (protéines PrPSc toxiques anormales) diffèrent des protéines PrPC (natives) en étant résistantes à l'action de la protéinase K, tandis que les PrPC sont sensibles à son action.
D'autres auteurs ont décrit que dans la structure de la PrPSc, il existe des parties sensibles et d'autres résistantes à la protéinase K. Cependant, les deux parties sont également toxiques et infectieuses..
D'autre part, Bastian et al.En 1987 ont isolé 4 protéines de 28, 30, 66 et 76 kda d'une espèce de Spiroplasma mirum. Tous se sont révélés résistants à l'action de la protéinase K et avaient également une réaction croisée avec certains prions..
On sait que cette espèce peut causer des cataractes et des dommages neurologiques importants et en raison des découvertes scientifiques de Bastian, entre autres recherches, une tentative a été faite pour lier ce micro-organisme aux encéphalopathies spongiformes transmissibles..
Cependant, l'étiologie de cette pathologie neurologique dégénérative continue d'être attribuée aux prions aujourd'hui..
En ce sens, Butler et al.En 1991 ont identifié et caractérisé une classe de protéines résistantes à la protéinase K de 40 kda à partir de deux souches de Mycoplasma hyorhinis. Ce pathogène affecte les porcs, infectant leurs tissus, mais dans ce cas, il n'y a pas eu de réaction croisée avec les prions testés..
Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour élucider de nombreuses inconnues à cet égard.
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