le Test de Voges-Proskauer est un test biochimique utilisé pour aider à identifier les bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Il est particulièrement utile pour différencier les souches de Escherichia coli de Klebsiella et Enterobacter, entre autres.
Le test est réalisé dans un milieu de culture liquide appelé Methyl Red-Voges Proskauer, mieux connu sous l'acronyme RM / VP. Ce milieu est composé de polypeptone tamponnée, de glucose, de phosphate dipotassique et d'eau distillée..
Le milieu RM / VP actuel est une modification du milieu Clark et Lubs, qui contenait à l'origine une concentration plus faible de peptones et de glucose. Par conséquent, moins de l'ion hydrogène, requis pour la réaction positive de Voges-Proskauer, a été produit..
Le test est basé sur la capacité du micro-organisme à utiliser le glucose par la voie butylène-glycol et à former un produit final neutre appelé acétoïne, en présence d'oxygène et d'un pH alcalin..
Dans le milieu RM / VP, en plus de pouvoir révéler le test de Voges-Proskauer, le test au rouge de méthyle peut également être révélé.
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Les pluripeptones présents dans le milieu fournissent les besoins nutritionnels essentiels à la croissance bactérienne. De son côté, le glucose est le principal composé. De nombreuses bactéries ont la capacité de métaboliser le glucose et de former de l'acide pyruvique.
L'acide pyruvique est un point médian du métabolisme du glucose et à partir de là, chaque micro-organisme peut emprunter différentes voies. Certains formeront des acides mixtes, tels que l'acide lactique, l'acide acétique, l'acide formique et l'acide succinique, et d'autres formeront des produits neutres comme le 2,3-butanediol..
Le test de Voges-Proskauer révèle la capacité du micro-organisme à former de l'acétyl méthyl carbinol (acétoïne), un produit intermédiaire du 2,3-butanediol dans des conditions aérobies.
L'acétoïne est réduite et forme du 2,3-butanediol, mais cette réaction est réversible, donc si le 2,3-butanediol est oxydé, il se forme de l'acétoïne. Par conséquent, l'oxygène est essentiel.
Le phosphate dipotassique est le tampon qui tamponne le mélange à pH 6,9 ± 0,2.
Pour démontrer la réaction, un développement doit être réalisé à l'aide de deux réactifs (réactifs Barrit), appelés Voges A et Voges B.
Voges A est une solution à 5% d'α-naphtol et Voges B est une préparation d'hydroxyde de potassium à 40%. Si l'hydroxyde de potassium n'est pas disponible, il peut être remplacé par de l'hydroxyde de sodium à 40%.
Le Α-naphtol est un catalyseur qui augmentera l'intensité de la couleur de la réaction, rendant le test plus sensible. L'α-naphtol doit toujours être ajouté en premier, en secouant le tube pour que le milieu entre en contact avec l'oxygène. De cette manière, l'acétoïne présente est oxydée en diacétyle et le 2,3-butanediol est oxydé pour former de l'acétoïne, en le faisant passer en diacétyle..
C'est ainsi que l'α-naphtol se liera au diacétyle, qui à son tour rejoint le noyau guanidine présent dans l'acide aminé arginine, ce dernier provenant des pluripeptones.
De son côté, l'hydroxyde de potassium ou de sodium est responsable de l'absorption du COdeux et de réagir avec des peptones. Cette réaction provoque la formation d'une couleur rose saumon, bien visible après avoir très bien agité le tube..
Des quantités correctes de diacétyle, de peptone et d'α-naphtol doivent être mélangées pour que la couleur apparaisse instantanément. Si cela ne se produit pas, on laisse le tube reposer pendant 15 minutes avant d'interpréter..
Habituellement, le test est positif après 2 à 5 minutes, lorsqu'une légère couleur rose peut être observée. En cas de repos de 30 min à 1 heure, l'intensité de la couleur sera maximale (rouge intense).
Un test négatif apparaîtra lorsque le bouillon vire au jaune. Après 1 heure, si le test est négatif, une couleur cuivrée peut se former suite à la réaction de l'hydroxyde de potassium sur l'α-naphtol.
Peser 17 g du milieu de culture déshydraté et dissoudre dans un litre d'eau distillée. Laisser reposer 5 minutes. Chauffer à ébullition pour dissoudre complètement. Servir 3 à 4 ml en tubes et stériliser en autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes.
Le milieu de culture déshydraté est de couleur beige et le milieu préparé est de couleur ambre clair..
Le pH final du milieu est de 6,9 ± 0,2.
Peser 5 g d'α-naphtol et dissoudre dans 50 ml d'alcool éthylique (absolu). Continuez ensuite à ajouter de l'alcool éthylique jusqu'à ce qu'il atteigne 100 ml..
Peser 40 g d'hydroxyde de potassium et dissoudre dans 50 ml d'eau distillée dans un bécher. Le verre doit être placé dans un bain d'eau froide pour contrôler la température, car lorsque la préparation est dissoute, la température augmente fortement.
Une fois la solution froide, elle est transférée dans une fiole jaugée et complétée à 100 ml avec de l'eau distillée..
Pour réaliser le test Voges-Proskauer, un bouillon RM / VP est ensemencé avec le microorganisme étudié, à partir d'une culture pure pendant 18 à 24 heures..
L'inoculum ne doit pas être très dense. Il est incubé à 35-37 ° C pendant 24 à 48 heures, bien qu'une incubation de plusieurs jours soit parfois nécessaire. Cowan et Steel pensent que 5 jours est le temps d'incubation minimum nécessaire pour détecter toutes les espèces positives de Voges-Proskauer (VP) de la famille des Enterobacteriaceae..
Séparer une aliquote de 1 mL dans un tube et développer comme suit: Placer 12 gouttes (0,6 mL) de réactif Voges A et 4 gouttes (0,2 mL) de Voges B. Mélanger pour aérer et laisser reposer pendant 5 à 10 minutes avant d'interpréter. Cependant, si le test est toujours négatif, laissez-le reposer et observez le tube après 30 minutes à 1 heure..
L'apparition d'une couleur rouge rosé indique que la réaction de Voges-Proskauer est positive. Si le milieu reste jaune, la réaction est négative.
L'ajout de développeurs dans l'ordre et la quantité indiqués est essentiel pour éviter les faux négatifs..
Le test de Voges-Proskauer est utile pour différencier les souches de E. coli qui sont VP négatifs, des genres Klebsiella, Enterobacter, Serratia, entre autres, qui sont VP positifs.
Des souches de contrôle peuvent être utilisées pour tester la qualité du milieu préparé, y compris Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium et Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Les résultats attendus sont des réactions de Voges-Proskauer positives uniquement pour K. pneumoniae Oui E. cloacae. Le reste donne des réactions négatives.
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