le DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) C'est un colorant qui, en raison de sa propriété fluorescente, sert de marqueur, étant largement utilisé dans la technique de microscopie à fluorescence ou de cytométrie en flux, entre autres. La fluorescence qu'il émet est bleu vif, son excitation se produit entre 455-461 nm (lumière UV).
Le colorant DAPI peut passer à travers la membrane cellulaire des cellules mortes avec une grande facilité. Il peut également tacher les noyaux des cellules vivantes, mais dans ce cas, la concentration de celui-ci doit être plus élevée.
Le colorant est capable d'accéder à l'ADN cellulaire pour lequel il a une affinité particulière, se liant avec une grande avidité aux bases azotées adénine et thymine. Pour cette raison, il est très utile dans certaines techniques de biologie moléculaire..
Ce composé appartient au groupe des colorants indoliques et s'est avéré avoir une plus grande sensibilité à l'ADN que le bromure d'éthidium et l'iodure de propidium, en particulier sur les gels d'agarose..
L'utilisation de ce colorant fluorescent est très large, car il est utile pour: étudier les changements d'ADN dans les processus apoptotiques (mort cellulaire) et donc détecter les cellules dans ce processus; pour l'empreinte photo ADN (impression photo ADN); étudier la contamination bactérienne; ou pour visualiser la segmentation nucléaire.
Il a également été utilisé dans l'étude des bandes chromosomiques, dans la détection de l'ADN de Mycoplasmes sp, dans l'interaction ADN-protéine, dans la coloration et le comptage des cellules par immunofluorescence et même pour colorer les grains de pollen matures.
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DAPI est l'abréviation de son nom chimique (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole). Sa formule moléculaire est C16HquinzeN5. Il a un poids moléculaire de 350,3. Près de la plage de lumière UV (345 à 358 nm), l'excitation maximale du complexe DAPI-ADN se produit, tandis que l'émission de fluorescence maximale se produit entre 455 et 461 nm..
Ce colorant se caractérise par être une poudre jaune, mais les structures marquées de ce fluorophore émettent une lumière bleue brillante..
C'est un composé soluble dans l'eau, cependant, pour accélérer sa dissolution, une certaine chaleur peut être appliquée. Il peut être dilué avec du PBS mais pas directement dissous dans celui-ci..
Une fois le colorant préparé, il doit être conservé dans l'obscurité, c'est-à-dire à l'abri de la lumière, à une température de 2 à 8 ° C (réfrigérateur). Dans ces conditions, le colorant est stable pendant plus de 3 semaines ou mois..
S'il est protégé de la lumière mais laissé à température ambiante, sa stabilité tombe à 2 ou 3 semaines, mais exposé à la lumière directe la détérioration est très rapide. Si vous souhaitez conserver plus longtemps, il peut être réfrigéré à -20 ° C réparti en aliquotes.
Cette coloration est basée sur la génération d'une contre-coloration nucléaire dans les principales techniques de biologie moléculaire, telles que: la cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence et la coloration des chromosomes en métaphase ou des noyaux interphase, entre autres..
Cette technique repose sur la grande affinité du colorant pour les bases azotées (adénine et thymine) contenues dans le matériel génétique (ADN) dans le petit sillon. Alors qu'au niveau cytoplasmique, il laisse très peu de fond.
Lorsque le colorant fluorescent se lie aux régions adénine et thymine de l'ADN, la fluorescence augmente considérablement (20 fois plus). La couleur qu'il émet est le bleu vif. Notamment, il n'y a pas d'émission de fluorescence lors de la liaison aux paires de bases GC (guanine-cytosine).
Il est important de noter que bien qu'il ait également une affinité pour l'ARN, cela ne pose pas de problème, car le plus haut degré d'émission d'énergie de cette molécule se produit à une autre longueur d'onde (500 nm), contrairement à l'ADN, qui le fait à 460 nm. . De plus, l'augmentation de la fluorescence une fois attachée à l'ARN n'est que de 20%..
Le DAPI est plus utilisé pour colorer les cellules mortes (fixées) que les cellules vivantes, car une concentration beaucoup plus élevée du colorant est nécessaire pour colorer ces dernières, c'est parce que la membrane cellulaire est beaucoup moins perméable au DAPI lorsqu'elle est vivante..
Le colorant DAPI peut être utilisé en combinaison avec des fluorophores rouges et verts pour une expérience multicolore.
Le DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) est un excellent fluorophore et est donc largement utilisé dans diverses techniques et à des fins diverses. L'utilisation du DAPI dans les principales techniques est expliquée ci-dessous.
Les chercheurs Gohde, Schumann et Zante en 1978 ont été les premiers à utiliser et proposer le DAPI comme fluorophore dans la technique de cytométrie en flux, avec un grand succès en raison de sa haute sensibilité à l'ADN et de sa haute intensité en émission de fluorescence..
L'utilisation du DAPI dans cette technique permet l'étude du cycle cellulaire, la quantification des cellules et la coloration des cellules vivantes et mortes..
Bien qu'il existe d'autres colorants, tels que le bromure d'éthidium, l'oxyde de Hoechst, l'orange d'acridine et l'iodure de propidium, le DAPI est l'un des plus utilisés car il est plus photostable que ceux mentionnés précédemment..
Pour cette technique, il est nécessaire de fixer les cellules, pour cela, de l'éthanol absolu ou du paraformaldéhyde à 4% peut être utilisé. L'échantillon est centrifugé et le surnageant est jeté, ensuite les cellules sont hydratées en ajoutant 5 ml de tampon PBS pendant 15 minutes..
Pendant que le temps s'écoule, préparer le colorant DAPI avec un tampon de coloration (FOXP3 de BioLegend) à une concentration de 3 µM.
Centrifuger l'échantillon, jeter le surnageant puis couvrir avec 1 ml de solution DAPI pendant 15 minutes à température ambiante..
Apportez l'échantillon au cytomètre en flux avec le laser approprié.
Une autre technique dans laquelle le DAPI est utilisé est la micro-fluorométrie en flux avec un autre fluorophore appelé mithramycine. Les deux sont utiles pour quantifier l'ADN de chloroplaste individuellement, mais le DAPI est le mieux adapté pour mesurer les particules de bactériophage T4..
Cette technique utilise essentiellement des sondes ADN marquées avec un colorant fluorescent qui peut être DAPI..
L'échantillon nécessite un traitement thermique pour dénaturer l'ADN double brin et le convertir en deux brins simple brin. Par la suite, il est hybridé avec une sonde d'ADN dénaturée marquée au DAPI qui a une séquence d'intérêt..
Plus tard, il est lavé pour éliminer ce qui ne s'est pas hybridé, un contraste est utilisé pour visualiser l'ADN. Le microscope à fluorescence permet l'observation de la sonde hybridée.
Cette technique a pour but de détecter des séquences spécifiques dans l'ADN chromosomique, permettant de faire le diagnostic de certaines maladies.
Ces techniques cyto-moléculaires ont été d'une grande aide pour déterminer les détails de l'étude des caryotypes. Par exemple, il a montré les régions riches en paires de bases adénosine et thymine appelées régions hétérochromatiques ou bandes DAPI..
Cette technique est largement utilisée pour l'étude des chromosomes et de la chromatine chez les plantes et les animaux, ainsi que dans le diagnostic des pathologies prénatales et hématologiques chez l'homme..
Dans cette technique, la concentration de DAPI recommandée est de 150 ng / ml pour une durée de 15 minutes..
Les lames assemblées doivent être conservées à l'abri de la lumière entre 2 et 8 ° C.
Les cellules sont fixées avec 4% de paraformaldéhyde. Si d'autres colorants doivent être utilisés, le DAPI est laissé à la fin comme un contre-colorant et les cellules sont recouvertes d'une solution de PBS pendant 15 minutes. Pendant que le temps s'écoule, préparer la solution de DAPI en diluant avec du PBS, de sorte que la concentration finale soit de 300 µM.
Ensuite, l'excès de PBS est éliminé et recouvert de DAPI pendant 5 minutes. Il est lavé plusieurs fois. La lame est observée au microscope à fluorescence sous le filtre approprié.
Ce composé doit être manipulé avec précaution, car c'est un composé qui a des propriétés mutagènes. Le charbon actif est utilisé pour éliminer ce composé des solutions aqueuses qui vont être jetées..
Des gants, une blouse et des lunettes de sécurité doivent être utilisés pour éviter les accidents avec ce réactif. En cas de contact avec la peau ou les muqueuses, la zone doit être lavée avec suffisamment d'eau.
Vous ne devez jamais pipeter ce réactif à la bouche, utilisez des pipettes.
Ne pas contaminer le réactif avec des agents microbiens car cela entraînerait des résultats erronés.
Ne diluez pas le colorant DAPI plus que recommandé, car cela diminuera considérablement la qualité de la coloration..
N'exposez pas le réactif à la lumière directe et ne le gardez pas au chaud car cela réduit la fluorescence.
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