La Chromatographie en phase liquide à haute performance C'est une technique instrumentale utilisée en analyse chimique avec laquelle il est possible de séparer les mélanges, de purifier et de quantifier leurs composants, ainsi que de mener d'autres études. Il est connu sous l'abréviation HPLC, dérivée de l'anglais: Chromatographie en phase liquide à haute performance.
Ainsi, comme son nom l'indique, il fonctionne en manipulant des liquides. Ceux-ci consistent en un mélange composé de l'analyte ou de l'échantillon d'intérêt et d'un ou plusieurs solvants qui agissent comme la phase mobile; c'est-à-dire celui qui entraîne l'analyte à travers tout l'équipement HPLC et la colonne.
La HPLC est largement utilisée par les laboratoires d'analyse de la qualité dans de nombreuses entreprises; comme les produits pharmaceutiques et les aliments. L'analyste en question doit préparer l'échantillon, la phase mobile, vérifier la température et d'autres paramètres, et placer les flacons à l'intérieur de la roue ou du carrousel pour que l'équipement effectue les injections automatiquement..
L'équipement HPLC est couplé à un ordinateur à travers lequel les chromatogrammes générés peuvent être observés, ainsi que pour lancer les analyses, contrôler le flux de la phase mobile, programmer le type d'élution (isocratique ou gradient), et allumer les détecteurs ( UV -Vis ou spectrophotomètre de masse).
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Contrairement à la chromatographie liquide conventionnelle, telle que la chromatographie sur colonne remplie de papier ou de gel de silice, la HPLC ne dépend pas de la gravité pour que le liquide mouille la phase stationnaire. Au lieu de cela, il fonctionne avec des pompes haute pression, qui irriguent la phase mobile ou l'éluant à travers la colonne avec une plus grande intensité..
De cette manière, il n'est pas nécessaire de verser la phase mobile de temps en temps à travers la colonne, mais le système le fait en continu et avec des débits plus élevés..
Mais l'efficacité de cette technique n'est pas uniquement due à ce détail, mais aussi aux minuscules particules de charge qui composent la phase stationnaire. Étant plus petite, sa zone de contact avec la phase mobile est plus grande, elle interagira donc mieux avec l'analyte et ses molécules se sépareront davantage..
Ces deux caractéristiques, ajoutées au fait que la technique permet le couplage de détecteurs, rendent la HPLC bien supérieure à la chromatographie sur couche mince ou sur papier. Les séparations sont plus efficaces, la phase mobile se déplace mieux à travers la phase stationnaire et les chromatogrammes peuvent détecter toute défaillance de l'analyse.
Ci-dessus, un schéma simplifié du fonctionnement de l'équipement HPLC. Les solvants se retrouvent dans leurs conteneurs respectifs, agencés avec des tuyaux de telle sorte que la pompe en prend un petit volume dans l'équipement; donc nous avons la phase mobile.
La phase mobile ou éluant doit d'abord être dégazée, afin que les bulles n'affectent pas la séparation des molécules d'analyte, qui est mélangée à la phase mobile une fois que l'équipement a effectué les injections..
La colonne chromatographique est située à l'intérieur d'un four qui permet de réguler la température. Ainsi, pour différents échantillons, il existe des températures adéquates pour réaliser des séparations haute performance, ainsi qu'un large catalogue de colonnes et de types de remplissages ou de phases stationnaires pour des analyses spécifiques..
La phase mobile avec l'analyte dissous entre dans la colonne, et à partir de celle-ci, les molécules qui «ressentent» moins d'affinité pour la phase stationnaire sont éluées en premier, tandis que celles qui sont plus retenues par elle sont éluées plus tard. Chaque molécule éluée génère un signal affiché sur le chromatogramme, où les temps de rétention des molécules séparées sont observés..
Et d'autre part, la phase mobile après avoir traversé le détecteur se retrouve dans une poubelle..
Il existe de nombreux types de HPLC, mais parmi tous les plus remarquables sont les quatre suivants.
La chromatographie en phase normale se réfère à celle où la phase stationnaire est de nature polaire, tandis que la phase mobile est non polaire. Bien qu'elle soit dite normale, elle est en fait la moins utilisée, la phase inverse étant la plus répandue et la plus efficace..
Étant une phase inverse, maintenant la phase stationnaire est apolaire et la phase mobile polaire. Ceci est particulièrement utile dans l'analyse biochimique, car de nombreuses biomolécules se dissolvent mieux dans l'eau et les solvants polaires..
Dans ce type de chromatographie, l'analyte, avec une charge positive ou négative, se déplace à travers la colonne, remplaçant les ions qu'il abrite. Plus la charge est élevée, plus sa rétention est élevée, c'est pourquoi il est largement utilisé pour séparer les complexes ioniques de métaux de transition..
Cette chromatographie, plutôt que de séparer, est chargée de purifier le mélange résultant. Comme son nom l'indique, l'analyte n'est plus séparé en fonction de son lien étroit avec la phase stationnaire, mais en fonction de sa taille et de ses masses moléculaires..
Les molécules plus petites seront plus retenues que les grosses molécules, car ces dernières ne sont pas piégées entre les pores des charges polymères de la colonne.
HPLC permet une analyse à la fois qualitative et quantitative. Sur le plan qualitatif, en comparant les temps de rétention du chromatogramme dans certaines conditions, la présence d'un composé particulier peut être détectée. Une telle présence peut indiquer une maladie, une adultération ou une consommation de drogue..
C'est donc une partie informatique des laboratoires de diagnostic. De même, on le retrouve dans les industries pharmaceutiques, car il permet de vérifier la pureté du produit, ainsi que sa qualité au regard de sa dissolution dans l'environnement gastrique. Les matériaux de départ sont également soumis à une HPLC pour les purifier et assurer de meilleures performances dans la synthèse des médicaments..
La HPLC permet l'analyse et la séparation de mélanges complexes de protéines, d'acides aminés, de glucides, de lipides, de porphyrines, de terpénoïdes et constitue essentiellement une excellente option pour travailler avec des extraits de plantes.
Enfin, la chromatographie d'exclusion moléculaire vous permet de sélectionner des polymères de différentes tailles, car certains peuvent être plus petits ou plus grands que d'autres. De cette manière, on obtient des produits de masse moléculaire moyenne faible ou élevée, ce qui est déterminant dans leurs propriétés et leurs applications ou synthèses futures..
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