La test de coagulase c'est une technique de laboratoire utilisée pour révéler la présence de l'enzyme coagulase. Cette enzyme a la propriété de coaguler le plasma. Loeb en 1903 a été le premier à décrire cette enzyme.
Ce test est réalisé sur des cocci à Gram positif, catalase positive, permettant de distinguer les souches de Staphylococcus aureus du reste des staphylocoques, car c'est le seul micro-organisme d'importance clinique qui le produit.
En ce sens, les membres de la famille des staphylococacées dont le test est négatif sont souvent appelés staphylocoques à coagulase négative..
Il existe différentes souches à S. aureus qui peut produire de la coagulase, telle que Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius et S. delphini.
Cependant, les trois premiers ont une importance clinique au niveau vétérinaire et pourraient très rarement être trouvés comme un agent causal d'infections chez l'homme, alors que S. delphini on ne le trouve que dans les milieux marins.
De plus, ils se différencient facilement car S. hyicus Oui S. intermedius ne pas fermenter le mannitol et S. schleiferi spp coagulans ne fermente pas le maltose, ni le tréhalose, tandis que S. aureus fait fermenter ces glucides.
La présence de l'enzyme coagulase a été liée à la virulence des souches. Cependant, cette théorie est en train de s'effondrer, compte tenu du fait que l'on observe d'autres espèces virulentes à coagulase négative capables de produire des infections importantes..
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Staphylococcus aureus produit deux types de coagulase, une qui reste attachée à la paroi cellulaire, également appelée facteur d'agglutination ou facteur réactif de coagulase (CRF), et une extracellulaire qui est libérée dans des cultures liquides. C'est pourquoi ils sont appelés respectivement coagulase liée et coagulase libre..
L'enzyme coagulase doit son nom à l'action qu'elle produit. Cela a la capacité de transformer le fibrinogène en fibrine, créant un caillot évident lorsqu'il est trouvé dans le plasma, c'est-à-dire que cette enzyme simule l'activité de la thrombine dans la cascade de coagulation.
En fait, l'une des théories les plus largement acceptées est que la coagulase liée réagit avec la coagulase libre pour activer les facteurs de coagulation. Cette activation génère une substance qui agit de la même manière que la prothrombine, créant un composé ayant la fonction de thrombine..
La différence avec la cascade de coagulation normale est que cette réaction ne nécessite pas la présence de calcium et n'est pas affectée par l'héparine.
Pour réaliser le test de la coagulase, il suffit de faire face à une culture fraîche de Staphylococcus avec un plasma de préférence de lapin et d'observer ainsi la formation ou non du caillot.
Il existe des techniques spécifiques pour détecter la coagulase liée et la coagulase liée et libre en même temps..
Certaines souches de S. aureus ils donnent un résultat positif plus rapidement que les autres. Le taux de formation de caillots est directement proportionnel à la concentration de coagulase présente..
Le test de coagulase sur lame détecte la coagulase liée et le test en tube détecte à la fois la coagulase liée et la coagulase libre.
-Nettoyer la diapositive
-On peut également utiliser du plasma de lapin de préférence, du plasma humain ou de cheval. Le plasma peut être acheté dans le commerce lyophilisé et reconstitué pour être utilisé, ou il peut être utilisé frais (frais). Une autre alternative viable est l'utilisation du fibrinogène.
-Solution saline stérile (0,85%) (SSF).
Prélevez du sang veineux humain ou animal. L'un des anticoagulants suivants peut être utilisé: EDTA, oxalate de calcium, héparine ou citrate de sodium. Bien mélanger et centrifuger. Retirer aseptiquement le surnageant (plasma), sans globules rouges et placer dans un tube stérile.
Reconstituer comme indiqué sur le flacon du kit commercial.
En utilisant du plasma citraté, mélanger le plasma à parts égales avec une solution saturée de chlorure de sodium. Laisser précipiter et centrifuger.
Jeter le surnageant, reconstituer le précipité jusqu'à 5 fois son volume avec de l'eau distillée stérile. Ajouter 5 unités d'héparine pour chaque ml de fibrinogène. Conserver dans un tube stérile.
Une goutte de solution saline et une goutte de plasma sont placées séparément sur une lame. Prélever avec la boucle de platine 1 ou 2 colonies pures du microorganisme à tester.
Mélanger la charge bactérienne dans la goutte de plasma et répéter l'opération sur la goutte SSF. Observez immédiatement les résultats. Un résultat positif sera celui dans lequel la formation d'un agglutinat macroscopique (précipité blanc) est observée après une minute sur le côté de la goutte avec du plasma.
La goutte SSF sert de contrôle négatif. Si une agglutination est observée avec la SSF, cela signifie que le micro-organisme s'auto-agglutine, ce qui peut donner des résultats faussement positifs. Dans ce cas, il doit être corroboré avec le tube à essai.
Il est également recommandé de monter un contrôle positif avec une souche connue de S. aureus.
Agglutination en 5 à 20 secondes (test fortement positif).
Agglutination variable survenant entre 20 secondes et une minute (test positif retardé).
Un certain degré d'agglutination après une minute (preuves douteuses). Il est recommandé de répéter le test ou de confirmer par la méthode du tube.
Pas d'agglutination (test négatif).
Résultat avec SSF. Il doit toujours donner un résultat négatif, s'il donne automatiquement un résultat positif, le résultat du test est invalidé.
-Tube à essai stérile
-Plasma
-Bain-marie à 37 ° C.
Pipeter 0,5 ml de plasma dans un tube à essai 12 x 75 avec une pipette stérile. Charger la boucle de platine avec 2 à 4 colonies pures à étudier à partir d'une culture solide pendant 18 à 24 heures et dissoudre dans le plasma soigneusement mélanger et incuber à 37 ° C pendant 4 heures.
Examinez le tube dans la première heure sans le secouer, inclinez-le doucement. Si un caillot n'est toujours pas vu, il peut être observé toutes les 30 minutes jusqu'à ce que les 4 heures soient terminées. Si après 4 heures, il est toujours négatif, il peut être laissé jusqu'à 24 heures mais à température ambiante. Observer et rapporter le résultat.
Sur la base de l'expérience, certains microbiologistes recommandent d'utiliser 500 µl d'une suspension bactérienne provenant d'une culture de 18 heures en milieu liquide pour effectuer le test..
Il semble offrir des résultats plus rapides et plus fiables que lors de l'émulsification de colonies à partir de milieux solides, en particulier si du plasma humain obtenu à partir de la banque de sang a été utilisé..
L'utilisation de souches issues d'un bouillon aide à diluer la présence éventuelle d'anticorps anti-staphylococciques humains dans le plasma qui peuvent inhiber l'action de la coagulase..
Si un caillot englobe tout le liquide (coagulation complète) ou un caillot sans rien dans le liquide restant (coagulation partielle), il doit être considéré comme un test positif..
Si aucun caillot ne se forme, c'est-à-dire que la suspension reste homogène, le test est négatif.
Le fibrinogène est utilisé de la même manière que le plasma et est utilisé à la fois pour les tests sur lame et en tube. Procéder comme décrit pour le plasma et interpréter de la même manière.
Il est utilisé pour différencier les Staphylococcus aureus des staphylocoques à coagulase négative.
Avoir des cultures fraîches d'une souche de S. aureus à utiliser comme contrôle positif. Une souche de S. epidermidis comme contrôle négatif.
-Un test positif ne doit pas être laissé en incubation pendant 24 heures, car le S. aureus produit une fibrinolysine qui dissout le caillot.
-Pour un test fiable, du plasma frais ou nouvellement reconstitué doit être utilisé, ainsi qu'il est important d'utiliser des cultures bactériennes fraîches (18 à 24 h). Cela évite les faux négatifs.
-Le test doit être effectué en conjonction avec un contrôle négatif et positif.
-Certains milieux solides peuvent interférer avec le test de la coagulase. Il n'est pas recommandé d'utiliser des colonies de gélose au mannitol salé.
-Si du plasma citraté est utilisé, il est recommandé de placer 5 unités d'héparine par ml de plasma pour éviter les faux positifs. En effet, certains micro-organismes autres que S. aureus ils peuvent décomposer le citrate et provoquer la coagulation du plasma. Dans ce cas, il est conseillé de faire un test de Gram et de catalase..
-Il est important, dans le test en tube, de surveiller la réaction toutes les 30 minutes, car il existe des souches de S. aureus Ils produisent des concentrations élevées de fibrinolysine et dilueront rapidement le caillot nouvellement formé. Évitez les faux négatifs.
-Lors de la surveillance du test, évitez de secouer brusquement le tube, cela peut détruire l'initiation de la formation de caillots qui ne sera pas restaurée plus tard, provoquant de faux négatifs.
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